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miTarget? miRNA 3′ UTR 克隆
miRNA 3′ UTR 克隆
復(fù)能基因提供哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的人、小鼠、大鼠miRNA 3′ UTR克隆，可用于miRNA靶標(biāo)驗(yàn)證、預(yù)測(cè)靶標(biāo)的功能確證和miRNA對(duì)靶標(biāo)的調(diào)控作用的研究。本公司提供兩套3’UTR報(bào)告載體。在pEZX-MT05載體中，我們將3’UTR序列（來(lái)源于公開(kāi)的基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)）插入到Gaussia熒光素酶報(bào)告基因下游，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中由SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄生成Gaussia熒光素酶（Gluc）和3’UTR靶標(biāo)序列的嵌合mRNA，因此無(wú)需裂解細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)Gluc的表達(dá)，研究mRNA-miRNA的相互作用。在相同載體（pEZX-MT05）上帶有分泌型堿性磷酸酶（SEAP）報(bào)告基因。CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的SEAP作為同質(zhì)粒內(nèi)的對(duì)照，這種雙報(bào)告系統(tǒng)可以對(duì)多樣本常規(guī)轉(zhuǎn)染進(jìn)行精確比較。pEZX-MT06是Firefly/Renilla雙熒光素酶報(bào)告載體。3’UTR序列在Firefly（hLuc）熒光素酶報(bào)告基因下游，CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的Renilla（hRLuc）作為同質(zhì)粒內(nèi)的對(duì)照。通過(guò)裂解細(xì)胞檢測(cè)hLuc和hRLuc的表達(dá)。
圖1. miRNA 3′ UTR克隆載體骨架
圖2. 靶標(biāo)序列（3′ UTR）表達(dá)克隆中miRNA的抑制作用
已知LIN28基因是miR-125a的靶標(biāo)。HEK 293細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lin28 miRNA靶標(biāo)序列表達(dá)克?。ㄗ螅┗蛘吖厕D(zhuǎn)染miR-125a前體miRNA表達(dá)克?。ㄓ遥?。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后檢測(cè)GLuc 和內(nèi)參SEAP活性。僅轉(zhuǎn)染Lin28 miRNA靶標(biāo)序列表達(dá)克隆的細(xì)胞中Gluc和SEAP活性之比定為1（左），以此確定共轉(zhuǎn)樣本中的比值。如圖所示，miR-125a抑制了GLuc-LIN28-3′-UTR克隆中Gluc 70%以上的活性。